Curcumin alleviates myocardial inflammatory responses by inhibiting Wnt5a/β-Catennin pathway after coronary microembolization in rats
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摘要目的
探索姜黄素对大鼠冠状动脉微栓塞(CME)后心肌炎症反应的潜在机制。
方法将32只SD大鼠随机分为假手术组、CME组(模型组)、CME+姜黄素组(姜黄素组)、CME+姜黄素+Foxy-5(激动剂组),每组8只。通过夹闭大鼠升主动脉并在左心室注射惰性聚苯乙烯微球构建大鼠CME模型。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中心肌肌钙蛋白(I cTnI)水平,苏木精—伊红(HE)染色观察大鼠心肌病理改变,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blotting)法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员5α(Wnt5α)和β-连环蛋白(β-Caten-nin)在心肌中的转录及蛋白表达水平。
结果与假手术组相比,模型组大鼠心功能显著下降,TNF-α、IL-1β、Wnt5a的转录及蛋白表达量均显著升高,而β-Catennin表达下调(均P<0.05)。与模型组相比,姜黄素组大鼠心功能升高,TNF-α、IL-1β、Wnt5a的转录及蛋白表达量显著下降,β-Catennin表达上调(均P<0.05)。激动剂Foxy-5显著逆转了姜黄素对上述指标的作用(P<0.05)。
结论姜黄素可通过抑制大鼠CME后Wnt5a/β-Catennin通路来减轻心肌炎症反应。
AbstractObjectiveTo explore the potential mechanisms of curcumin on myocardial inflammatory responses following coronary microembolization (CME) in rats.
MethodsThirty-two SD rats were randomly divided into a sham group, a CME group (model group), a CME + curcumin group (curcumin group), and a CME + curcumin + Foxy-5 group (agonist group), with 8 rats in each group. The CME model in rats was established by clamping the ascending aorta and injecting inert polystyrene microspheres into the left ventricle. Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) and western blotting (WB) were employed to detect the transcription and translation levels of interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), Wnt family member 5a (Wnt5a), and β-catenin in the myocardium.
ResultsCompared with the sham group, rats in the model group exhibited significantly decreased cardiac function, along with significantly elevated transcription and translation levels of TNF- α, IL-1β, and Wnt5a, while β-catenin expression levels showed a decrease (all P < 0.05). Compared with the model group, rats in the curcumin group showed an increasing trend in cardiac function, with significantly decreased transcription and translation levels of TNF-α, IL-1β, and Wnt5a, and an increase in β-catenin expression levels (all P < 0.05). The agonist Foxy-5 significantly reversed the effects of curcumin on the above indexes (P < 0.05).
ConclusionCurcumin can alleviate myocardial inflammatory responses by inhibiting the Wnt5a/β-catenin pathway following CME in rats.
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Keywords
- curcumin /
- coronary microembolization /
- inflammatory responses
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冠状动脉微栓塞(coronary microembolization, CME)是患者行溶栓治疗或者经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)而引起的一种常见且非常棘手的临床并发症[1],主要由动脉粥样硬化斑块自发性破裂后,斑块碎片和脂质等堵塞远端微循环所致[2]。CME常导致冠状动脉发生“慢血流”或“无血流”现象,进而引起心肌损伤,CME诱导的心肌炎症反应是导致心功能障碍的主要原因[3]。既往研究表明,姜黄素〔1, 7-双(4-羟基-3-甲氧基苯酚)-1, 6-庚二烯-3, 5-二酮〕属于一种亲脂性多酚,具有抵抗炎症的能力[4-6]。此外,已有研究表明,经常的膳食姜黄素或者姜黄素制剂可以保护心脏病发作患者的心功能,降低心血管疾病的死亡率[7]。Wnt信号转导主要通过调节基因转录来控制各种成虫和发育过程[8]。Wnt家族与心脏多种损伤方式的密切相关,Wnt5a是非典型Wnt家族中一种进化上保守的蛋白质之一[9]。β-Catennin是Wnt经典通路的传导,但该通路可受Wnt5a抑制[10]。本研究旨在探讨姜黄素预处理对大鼠CME诱导的心肌炎症反应的影响及其机制。
1. 材料与方法
1.1 药品与主要试剂
姜黄素、45 μm(直径)惰性聚苯乙烯微球(5×105个/mL)由美国Polyscience公司提供;肌钙蛋白(I cTnI)的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司;苏木精—伊红(HE)染色试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司;Trizol试剂购于美国Invitrogen公司;cDNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司提供;RIPA裂解液来自上海碧云天生物技术股份有限公司。
1.2 实验动物
32只雄性SD大鼠,8周龄,体重250~300 g,购于广西医科大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK桂2020-0003。所有大鼠均被饲养在SPF级的动物房内,12 h明暗交替。本研究动物实验已取得广西医科大学动物研究伦理委员会批准(编号:202310007)。
1.3 CME模型的建立
腹腔注射10 %戊巴比妥钠溶液(3 mg/mL)麻醉大鼠。经口插管,连接至小动物呼吸机辅助通气。于大鼠胸骨左侧第3至第5肋间隙区域,行开胸手术,充分显露心脏及主动脉。使用血管弯钳夹闭升主动脉根部约10 s,同时将0.1 mL含有5 000个聚苯乙烯微球的生理盐水悬浮液注入左心室腔内(假手术组注入等体积生理盐水)。心率恢复正常后仔细缝合伤口,大鼠正常呼吸后拔除气管导管。
1.4 动物分组及处理
将32只SD大鼠随机分为假手术组、CME组(模型组)、CME+姜黄素组(姜黄素组)、CME+姜黄素+Foxy-5(激动剂组)。在造模前连续7 d,姜黄素组每天灌胃40 mg/kg姜黄素,激动剂组每天给予40 mg/kg姜黄素灌胃,并腹腔注射Wnt5a激动剂Foxy-5(Foxy-5溶解于DMSO后用生理盐水稀释至5 μg/μL),10 μL/只,每天1次[11]。
1.5 心功能检查
由于大鼠在CME模型建立后9 h心功能达到最低[12],本实验基于特定的时间考量,选定该时间节点作为评估心脏功能状态的关键时刻。采用Philips Sonos 7500型超声诊断仪分析大鼠的心脏功能变化。记录左心室射血分数(left ventricular ejection fractions, LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左心室舒末内径(left ventricular end diastolic diameter, LVEDd)、左心室缩末内径(left ventricular end systolic diameter, LVESd),同时测量3个心动周期,取平均值。所有操作由同一名超声医师采用盲法完成。
1.6 组织样本采集
心脏超声测定完成后,于各组大鼠尾静脉注射10 %氯化钾(2.0 mL),待大鼠心脏停在心动周期的舒张期时,立即取出心脏,除去心房及心耳,保留心底部及心尖部用于后续实验。
1.7 ELISA检测
cTnI水平收集大鼠腹主动脉血液于抗凝管内,离心后,吸取上清液,用ELISA法检测血清中心肌cTnI水平,检测过程严格按照试剂盒说明书操作。
1.8 HE染色
按照试剂盒说明书操作,制作心肌组织石蜡切片,常规脱蜡,用0.5%~1%盐酸酒精对细胞内染色质进行分色,0.5% 伊红染液染色,显微镜下观察心肌组织病理改变。
1.9 铁苏木素染色[13]
按照试剂盒的标准流程,对微梗死区域进行染色,黑色表示心肌微梗死灶。
1.10 RT-qPCR检测炎症因子及Wnt5α、β-Catennin mRNA相对表达水平
严格遵循Trizol试剂盒的操作指南,从心尖组织中精确称取50 mg样本,用以提取总RNA。随后对提取的RNA进行浓度测定,并利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。依据SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒的标准流程,对cDNA进行扩增,反应条件如下:预变性(95 ℃,30 s,循环1次);变性(95 ℃,10 s,循环40次);退火 & 延伸(60 ℃,30 s,循环40次);随后进入溶解过程(95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,15 s)。采用2-△△CT法分析各组肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、Wnt5a、β-Catennin的mRNA相对表达水平。所有引物均购自南宁捷尼斯生物科技有限公司,序列如下:TNF-α上游为5’-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3’,下游为5’-GCTTGGTGGTTTGCTACGACG-3’;IL-1β上游为5’-CTATGTCTTGCCCGTGGAGC-3’,下游为5’-GCAGGTCGTCATCATCCCAC-3’;Wnt5a上游为5’-AAAACGGTCAGTGTTGGCCT-3’,下游为5’-TTAGAGCTGTGCCTCCATGC-3’;β-Catennin上游为5’-TCCCAGTCCTTCACGCAAG-AG-3’,下游为5’-GTGGCAAGTTCCGCGTCATC-3’;内参GAPDH,上游引物序列为5’-TGGAGAAA-CCTGCCAAGTATGAT-3’,下游为5’-TATCCTTGC-TGGGCTGGGTG-3’。
1.11 蛋白质印迹(western blotting, WB)
从各组大鼠中精准称取了100 mg心肌组织样本。RIPA组织裂解液提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定法对提取蛋白浓度进行测定。将蛋白样品与Loading buffer混合,将蛋白煮沸10 min使其变性,各组取5 μL蛋白样品,在12% 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,通过湿法法转到PVDF膜上,5% 脱脂牛奶封闭1 h。随后加入TNF- α(1∶500)、IL-1β(1∶500)、Wnt5a(1∶1000)、β -Catennin(1∶1 000)、GAPDH (1∶3 000)一抗稀释液,4 ℃下孵育过夜。次日,加入稀释至1∶10 000的二抗溶液孵育1 h。滴加化学发光液,显影。利用Image J软件分析计算内参与目的蛋白条带的灰度值比值,以此作为该目的蛋白的相对表达量。
1.12 统计学方法
选用SPSS 23.0统计软件处理数据,计量资料以均数±标准差(x± s)表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,方差不齐则采用Games-Howell检验。实验独立重复3次,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组大鼠心功能比较
与假手术组相比,模型组LVEF、LVFS显著下降,LVEDd、LVESd显著增加(P<0.05);与模型组相比,姜黄素组LVEF、LVFS显著升高,LVEDd、LVESd显著缩短(P<0.05);与姜黄素组相比,激动剂组LVEF、LVFS显著下降,LVEDd、LVESd增加(P<0.05)。见图 1A、图 1B。
2.2 各组大鼠心肌组织的病理学变化
HE染色显示,与假手术组相比,模型组与激动剂组的HE染色结果中可以看到在大鼠心肌组织中有微球存在,且梗死区域中,细胞水肿,细胞核溶解,伴炎症细胞浸润,但姜黄素能逆转上述模型组中大鼠心肌的病理学变化,见图 2A。ELISA显示,与假手术组相比,模型组的cTnI表达水平显著升高(P<0.05),然而,与模型组相比,姜黄素组的却显著下降(P<0.05);与姜黄素组相比,激动剂组的cTnI表达水平显著升高(P<0.05)。见图 2B。铁苏木素染色显示,与假手术组相比,模型组的心肌微梗死面积显著扩大(P<0.05),然而,与模型组相比,姜黄素组的却显著缩小(P<0.05);与姜黄素组相比,激动剂组的心肌微梗死面积显著扩大(P<0.05)。见图 2C、图 2D。
2.3 各组大鼠心肌炎症因子及Wnt5a、β-Catennin mRNA相对表达量对比
相较于假手术组,模型组TNF-α、IL-1β、Wnt5a mRNA相对表达量显著升高,β-Catennin mRNA相对表达量下降(P<0.05);与模型组相比,姜黄素组TNF-α、IL-1β、Wnt5a mRNA相对表达量降低,β-Catennin mRNA相对表达量升高(P<0.05);与姜黄素组相比,激动剂组TNF-α、IL-1β、Wnt5a升高,β-Catennin mRNA相对表达量下降(P<0.05),见图 3A。
2.4 各组大鼠心肌炎症因子及Wnt5a、β-Catennin的蛋白表达水平对比
与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β及Wnt5a的蛋白表达量显著升高,β-Catennin蛋白表达量下降(P<0.05);与模型组相比,姜黄素组TNF-α、IL-1β、Wnt5a蛋白表达量显著降低,β-Catennin蛋白表达量升高(P<0.05);与姜黄素组相比,激动剂组TNF-α、IL-1β、Wnt5a蛋白表达量显著升高,β-Catennin蛋白表达量下降(P<0.05),见图 4A、图 4B。
3. 讨论
CME为PCI的常见并发症[14],动脉粥样硬化破裂或斑块破裂产生微栓子从而引起微梗死是其导致不良预后的主要因素[15]。CME在急性期时会在局部微梗死组织中出现大量炎性细胞浸润,炎症因子(如TNF-α、IL-1β)被释放,随之引发局部组织炎症反应,进而导致心肌收缩功能障碍,心肌酶升高,不良预后的发生率升高[16-18]。因此,缓解CME后心肌组织中的炎症反应是改善心肌收缩功能不全的有效的治疗策略。本研究成功构建CME模型,通过组织样本分析发现,与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织中TNF-α和IL-1β mRNA及蛋白表达水平显著升高,姜黄素组这些炎症因子的mRNA相对表达量及蛋白表达水平均显著降低。表明姜黄素成功逆转了CME后诱导的大鼠心肌组织的炎症反应,缓解心功能不全。
姜黄素对肥胖症有着积极的改善作用,其可以刺激白色脂肪细胞的产生,同时可以抑制与肥胖有关的脂肪组织的炎症反应[19]。研究显示,姜黄素提取物可以抑制高血浆中胆固醇水平的增长,降低肝脏线粒体对脂质过氧化的敏感性[20-22]。近年来越来越多的研究表明,姜黄素具有心血管保护作用。姜黄素可改善心梗后心室重塑[7],可下调缺血再灌注后的心肌组织中炎症因子的表达(如TNF-α、IL-1β)[23-24],并且通过激活JAK2/STAT通路来实现心肌保护作用[25-26]。本研究表明,采用姜黄素预处理的CME模型中,可明显逆转CME诱导的炎症反应,降低TNF-α及IL-1β的mRNA相对表达水平及蛋白相对表达水平,改善心功能障碍,此与Liu等[23]研究结果相一致。
首个Wnt基因int-1于1984年被发现。在感染乳腺肿瘤病毒(MMTV)的小鼠中发现了过表达的int-1,这是一种靠近MMTV序列整合位点的基因[27]。随后,在果蝇基因中发现wingless是int-1的同源物,于是Wnt1基因名称由此产生[28]。Wnt信号传导涉及经典(β-Catennin依赖性)与非经典途径(非β-Catennin依赖性),Wnt5a通常被认为是一种“非经典”的配体,可抑制经典信号传导[10]。Wnt是高度保守、疏水、富含半胱氨酸的分泌配体,可控制细胞增殖、迁移、分化和细胞凋亡[29]。Wnt激活的特定时间和位置对于包括心脏在内的多个器官和系统的正常发展是必要的[30]。本研究结果显示,在CME后,Wnt5a/β-Catennin通路传导增强,大鼠心肌炎症反应增加,而在姜黄素组中,Wnt5a/β-Catennin通路传导被抑制,大鼠心肌炎症反应减弱,然而,在激动剂组中,Wnt5a/β-Catennin通路传导增强,大鼠心肌炎症反应增加。这些结果表明,姜黄素可能通过抑制CME后大鼠心肌的Wnt5a/β-Catennin通路传导来发挥保护心脏的作用,该结果支持并拓展了Tian等[31]的研究。
本研究仍具有一些局限性:首先,本研究将物理微栓塞球注射到冠状动脉微血管中构建CME模型,由于这些塑料微球缺乏血管或血栓形成等生物学特征,因此这种塑料微球在CME模型中产生的病理改变与临床实践中动脉粥样硬化产生的病理改变不同;其次,只进行了小动物模型的研究,尚缺乏大动物模型的验证。
综上所述,姜黄素可能通过抑制大鼠CME后Wnt5a/β-Catennin通路减轻心肌炎症反应。本研究不仅深化了我们对姜黄素潜在治疗机制的理解,更为姜黄素在临床实践中作为预防及干预CME后心功能不全与心肌收缩障碍的策略提供了坚实的实验基础与科学依据。
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